Цитогенетичне дослідження мезенхімальних стовбурових клітин із пуповини щурів, культивованих in vitro

Анотація

Резюме. Результати преклінічних наукових досліджень та клінічних випробувань свідчать про високу ефективність використання стовбурових клітин для відновлення уражених патологією структур організму. Важливою умовою отримання високоякісного клітинного матеріалу для регенеративної медицини є підтримання цитогенетичної стабільності культури стовбурових клітин in vitro.

Мета дослідження – цитогенетично проаналізувати культуру клітин пуповинних канатиків ембріонів щурів на різних пасажах культивування та оцінити стабільність каріотипу культивованих стовбурових клітин.

Матеріали і методи. Для отримання мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) використовували пуповинні канатики щурів лінії WISTAR Rattus norvegicus Berkenhout. Аналіз проводили протягом 1–8 пасажів. Метафазні пластинки отримували за модифікованою стандартною методикою каріотипування. Після тригодинного інкубування у 10^-7 М розчині колхіцину, здійснювали трипсинізацію матеріалу. Далі фермент нейтралізували кондиційним середовищем і до клітин додавали теплий гіпотонічний розчин KCl (0,075 М). Матеріал фіксували оцтовим метанолом (1:3) на танучому льоді. Фіксатор замінювали тричі, потім суспензію клітин розкапували на холодні вологі предметні скельця. Зразки фарбували розчином Романовського – Гімзи. Цитогенетичний аналіз МСК проводили на 30 метафазних пластинках на кожному пасажі. В отриманих зразках виявляли кількісні порушення хромосомного набору (анеуплоїдію (АП), поліплоїдію (ПП)) та підраховували кількість клітин з мікроядрами (МЯ), мітотичний індекс (МІ). Частоту прояву АП, ПП та МЯ вираховували на 500 клітин (у %).

Результати. При дослідженні МСК пуповини щурів вже на перших пасажах виявлено поодинокі порушення в хромосомному наборі, такі, як АП та ПП. Кількість клітин із цитогенетичними аномаліями поступово зростала із збільшенням тривалості культивування, однак відсоток клітин з нормальним каріотипом не зменшився до восьмого пасажу більше ніж на 10 %. Відсоток АП на перших двох пасажах зростав від 1,5 до 1,9 %. При подальшому культивуванні до 6 пасажу рівень АП зріс майже в 3 рази. За два наступних пасажі кількість АП майже не змінилася. На перших двох пасажах відсоток ПП був мінімальний – 1,1–1,3 %. До шостого пасажу відзначали підвищення кількості таких клітин у 2,8 %. При культивуванні до восьмого пасажу подвоєння числа хромосом зросло ще в 1,1 раза. У першому пасажі в культурі МСК був зареєстрований дуже малий відсоток МЯ (≈0,2 %). При продовженні пасажування їхня кількість зросла на 2,9 %. Мітотичний індекс МСК зростав з першого до п’ятого пасажу з 3,9 до 4,8 %. З кожним наступним пасажем мітотичний потенціал клітин знижувався і до завершення аналізованого періоду культивування становив 3,1 %.

Висновки. Аналіз каріотипу клітин пуповини щурів за підібраних умов культивування показав незначне зростання відсотка АП та ПП. Також спостерігали низький відсоток клітин з мікроядрами. Отже, на ранніх пасажах дану клітинну лінію можна безпечно використовувати з терапевтичною метою для лікування змодельованих патологій у щурів.